背景：

大多数炎症性肠病（IBDs）患者对目前的治疗没有反应，随着时间的推移会失去疗效，或出现不良事件，需要进行结肠切除。因此，了解慢性胃肠炎症的发病机制，开发更特异性的靶向治疗方法是目前尚未满足和迫切需要的。

炎性小体是由核苷酸结合区域和富亮氨酸重复受体(NLR)蛋白组成的细胞质多蛋白复合物，如NLRP1、NLRP3、NLRC4和NLRP6，它们是内源性或外源性应激或损伤相关分子模式的天然传感器。NLRP6在肠道中高表达，在维持肠道稳态中发挥重要作用。NLRP6与ASC和caspase-1形成复合物，促进前IL-18裂解为具有生物活性的成熟IL-18。然而，NLRP6功能在调控以防止过度炎症的分子机制尚不清楚。

简介：

年6月，来自美国达拉斯UT西南医学中心的K.Venuprasad?教授课题组在NatureImmunology（IF:23.53）杂志上发表题为“DeubiquitinationofNLRP6inflammasomebyCyldcriticallyregulatesintestinalinflammation”的文章[1]。研究结果发现去泛素化抑制了NLRP6-ASC炎症小体复合物并调节IL-18的成熟。小鼠Cyld缺乏导致活性IL-18水平升高和柠檬酸杆菌啮齿菌感染后严重的结肠炎症。此外，在溃疡性结肠炎患者中，活性IL-18的浓度与CYLD的表达呈负相关。因此，该研究发现了一种抑制NLRP6-IL-18通路在肠道炎症中的调控机制。

主要结果：

柠檬酸杆菌在Cyld?/?小鼠中引起严重的炎症。

为研究Cyld表达缺陷对肠道炎症的影响，研究人员用柠檬酸杆菌接种了Cyld?/?小鼠和同窝野生型对照小鼠。与野生型小鼠相比，Cyld?/?小鼠的体重明显减轻，并且严重腹泻。与野生型小鼠相比，感染了柠檬酸杆菌的Cyld?/?小鼠结肠的长度显著缩短。Cyld?/?小鼠表现出更大的粘膜下水肿、更广泛的表面黏膜损伤和溃疡，提示Cyld?/?小鼠出现严重的结肠炎症。感染后，野生型和Cyld?/?小鼠粪便中的细菌数量相似，说明Cyld缺失并不影响初始细菌定植。然而，从第8天开始，Cyld?/?小鼠粪便中的细菌数量增加，提示Cyld缺失导致无法控制C.rodentium感染。Cyld?/?小鼠也表现出增强的细菌扩散到周围器官，包括脾脏和肝脏，提示上皮屏障被破坏。

图1：柠檬酸杆菌在Cyld?/?小鼠中引起严重的炎症

Cyld与NLRP6结合。

接下来，作者试图通过蛋白质组学方法识别导致Cyld?/?小鼠肠道严重炎症的失调通路。通过质谱（MS）分析，鉴定了NLRP6为Cyld沉淀中的Cyld结合蛋白。接下来，作者使用抗NLRP6和野生型小鼠炎症结肠黏膜的裂解物免疫沉淀NLRP6，随后进行MS分析。根据His-Cyldpulldown结果，作者在NLRP6的免疫沉淀中发现了十个与Cyld相对应的特异性肽。为了验证MS研究结果，研究人员用Myc-Cyld和Flag-NLRP6表达构建转染了T细胞。使用anti-Flag或anti-Myc免疫沉淀细胞裂解物。抗Myc免疫沉淀Flag-NLRP6和抗Flag免疫沉淀Myc-Cyld，提示Cyld和NLRP6存在物理相互作用。为检测Cyld-NLRP6是否直接相互作用，利用GST-Cyld和His-NLRP6进行了下拉分析。GST-Cyld而不是GST单独沉淀了His-NLRP6，证实Cyld-NLRP6的直接相互作用。

Cyld裂解NLRP6的k63连接泛素化。

为了研究Cyld是否通过去泛素化调节NLRP6，研究人员用Flag-NLRP6、Myc-Cyld和血凝素(HA)-Ub转染T细胞。作者观察到只有当NLRP6与Ub共表达时，NLRP6才会缓慢迁移、高分子量、多聚化形态。NLRP6泛素化作用在野生型Cyld中减弱，而在Cyld(CA)去泛素酶缺陷突变体中则没有减弱，这表明Cyld去泛素化作用于NLRP6。进一步发现Cyld可裂解k63连接的Ub链。为证实Cyld直接去泛素化NLRP6，研究人员将NLRP6标记与Ub共同表达。泛素化的NLRP6用Flag磁珠沉淀，然后用甘氨酸缓冲液洗脱。洗脱液依次用Flag磁珠免疫沉淀，然后与Cyld蛋白孵育。Cyld去泛素化NLRP6，提示Cyld直接去泛素化NLRP6。进一步，发现NLRP6的k63连接泛素化增强了其与ASC的相互作用。

图2：Cyld调控NLRP6蛋白的去泛素化。

活性IL-18在Cyld?/?小鼠中升高。

接下来，研究人员分析了感染C.rodentium的Cyld?/?和同窝野生型对照小鼠血清中IL-18的浓度，发现Cyld?/?小鼠中IL-18的含量明显高于野生型小鼠。类似，Cyld?/?结肠外植体培养上清中IL-18的浓度明显高于野生型外植体。为检测IL-18产生增多是由于IL-18信使RNA表达增加的可能性，使用基因特异性引物对从结肠组织分离的RNA进行了实时PCR实验。然而，在野生型和Cyld?/?组织中，IL-18mRNA的丰度是相似的，这表明IL-18的翻译后调控。为进一步证实这一发现，对结肠粘膜组织进行免疫印迹分析，以检测IL-18的裂解和未裂解形式。在Cyld?/?组织中，cleavedIL-18的水平显著升高。

中和IL-18可以挽救Cyld?/?小鼠免于严重结肠炎。

接下来，研究人员试图研究中和IL-18是否会挽救IEC-Cyld(Δ9)小鼠发展成为严重的结肠炎。与对照组相比，抗IL-18治疗明显改善了小鼠的体重减轻和腹泻评分。观察到抗IL-18治疗的小鼠比对照组小鼠结肠增厚更少。抗IL-18治疗可显著改善结肠增厚和屏障完整性。同样，与对照组小鼠相比，抗IL-18治疗小鼠的组织学评分有了显著提高。

图3：C.rodentium感染Cyld?/?小鼠后IL-18产生增加。

Cyld对于调节IL-18丰度至关重要。

为研究Il18基因缺失是否能拯救重度结肠炎的Cyld?/?小鼠，研究人员将Cyld?/?小鼠与Il18?/?小鼠进行杂交，生成Cyld?/?Il18?/?小鼠。Cyld?/?Il18?/?小鼠的原发性或次级淋巴器官、以及结肠结构未见明显变化。利用C.rodentium诱导Cyld?/?Il18?/?小鼠结肠炎。Real-timePCR和ELISA结果显示Cyld?/?Il18?/?小鼠结肠黏膜中未见Il18表达。进一步，为研究NLRP6和Cyld相互作用在调节IL-18中的作用，使用C.rodentium诱导NLRP6?/?、Cyld?/?和Cyld?/?NLRP6?/?小鼠结肠炎。大肠黏膜Il18mRNA的丰度相似；然而，Cyld?/?Nlrp6?/?小鼠结肠外植体中IL-18的浓度显著降低。在Cyld-/-Il18+/-和Cyld-/-Nlrp6+/-小鼠中诱导结肠炎，并与野生型和Cyld-/-对照小鼠的疾病严重程度进行比较。有趣的是，与Cyld-/-小鼠相比，Cyld-/-Il18+/-和Cyld-/-Nlrp6+/-小鼠的体重下降和腹泻明显减少。组织学检查结肠组织染色切片进一步表明，Cyld-/-Il18+/-和Cyld-/-Nlrp6+/-小鼠的结肠炎严重程度明显降低。

图4：杂合缺失Il18或Nlrp6可挽救Cyld?/?小鼠。

UC患者中IL-18与CYLD表达相关。

进一步研究了UC患者中CYLD的表达是否与激活的IL-18相关。作者观察到大量患者的CYLDmRNA表达水平较低。CYLDmRNA表达与IL-18活性产生呈强负相关(Pearson系数，P=-0.85)，说明IL-18的产生与CYLD基因表达相关。而CYLD与IL18mRNA丰度之间无显著相关(Pearson系数，P=-0.)，说明CYLD基因表达与IL18mRNA表达无关。同样，在UC患者中，CYLD的表达与TNF-α和IL6的表达也无显著相关性。这些数据强烈提示CYLD介导的IL-18活性水平调控在UC患者中具有临床意义。

结论：

总之，该研究揭示了调节NLRP6介导的IL-18成熟以预防结肠炎症的新机制。这些新发现可能为确定预防和治疗IBDs的新治疗方法提供理论依据。

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